Klíčový rozdíl - RAPD vs RFLP
Genetické markery se používají v molekulární biologii k identifikaci genetických variací mezi jednotlivci a druhy. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) a Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) jsou dva důležité molekulární markery běžně používané v laboratořích. RAPD se provádí s krátkými a libovolnými oligonukleotidovými primery a je založena na náhodné amplifikaci více míst v templátové DNA organismu. RFLP se provádí se specifickou restrikční endonukleázou a je založena na polymorfismu výsledných restrikčních fragmentů a hybridizaci. Klíčovým rozdílem mezi RAPL a RFLP je, že RAPD je typ PCR techniky prováděné bez předchozí znalosti sekvence, zatímco RFLP není zapojena do PCR a vyžaduje předchozí znalost sekvence k provedení této techniky.
OBSAH
1. Přehled a klíčový rozdíl
2. Co je RAPD
3. Co je RFLP
4. Porovnání vedle sebe - RAPD vs. RFLP
5. Shrnutí
Co je RAPD?
RAPD je užitečný molekulární marker v molekulární biologii. Je to rychlá a snadná technika. RAPD lze definovat jako metodu, která vede k polymorfním sekvencím DNA jako výsledek náhodné amplifikace více umístění templátu cílové DNA. RAPD používá pro amplifikaci PCR krátké oligonukleotidové primery s libovolnými sekvencemi. Primery jsou syntetizovány uměle bez předchozí znalosti sekvence. Považuje se tedy za snadnou a užitečnou techniku.
V RAPD jsou zahrnuty následující hlavní kroky.
- Extrakce cílové DNA
- Amplifikace více umístění cílové DNA pomocí náhodně vybraných primerů
- Gelová elektroforéza amplifikovaných produktů PCR
- Barvení ethidiumbromidem a identifikace polymorfismu
V důsledku variací v hybridizaci primeru se během amplifikace generují různé fragmenty s různými délkami. Pásové vzory na gelech se tedy u jednotlivců a druhů liší. RAPD tedy umožňuje detekci genetické variace mezi organismy při identifikaci a diferenciaci.
RAPD se používá v různých studiích molekulární biologie, jako je identifikace genetického rozdílu mezi blízce příbuznými druhy, mapování genů, otisky prstů DNA, identifikace dědičných chorob atd.
Obrázek 01: RAPD
Co je to RFLP?
Polymorfismy s délkou restrikčních fragmentů (RFLP) je molekulární marker používaný v molekulární biologii pro identifikaci genetické variace v homologních sekvencích DNA. Jedná se o první genetický marker vyvinutý pro otisky prstů DNA. Všechny organismy produkují jedinečné profily DNA, jsou-li omezeny specifickými restrikčními enzymy. RFLP slouží jako důležitý nástroj při vytváření jedinečných profilů DNA jednotlivců a detekce genetických variací mezi nimi. Když jsou vzorky DNA štěpeny specifickými restrikčními endonukleázami, poskytuje různé profily DNA, které jsou pro každého jedince jedinečné. Základem této metody je proto detekce genetických variací mezi organismy restrikcí homologní DNA specifickými restrikčními enzymy a analýza polymorfismu délky fragmentu gelovou elektroforézou a blotováním. Blotovací vzorce jsou pro každý organismus jedinečné a charakterizují konkrétní genotypy.
Následující kroky se týkají RFLP.
- Izolace dostatečného množství DNA ze vzorků
- Fragmentace vzorků DNA se specifickými restrikčními endonukleázami do krátké sekvence
- Separace výsledných fragmentů různé délky elektroforézou na agarózovém gelu.
- Přenos gelového profilu na membránu Southern blotováním
- Hybridizace membrány se značenými sondami a analýza polymorfismu délky fragmentu v každém profilu
RFLP má různé aplikace, jako je diagnostika dědičných chorob, mapování genomu, identifikace kriminality ve forenzních studiích, testování otcovství atd.
Obrázek 02: Genotypizace RFLP
Jaký je rozdíl mezi RAPD a RFLP?
Rozdílný článek uprostřed před tabulkou
RAPD vs RFLP |
|
| RAPD je molekulární marker založený na náhodných primerech a PCR. | RFLP je molekulární marker založený na produkci restrikčních fragmentů různé délky. |
| Požadovaný vzorek | |
| Pro analýzu RAPD stačí malé vzorky DNA. | Pro analýzu RFLP je zapotřebí velké množství extrahovaného vzorku DNA. |
| Čas | |
| RAPD je rychlý proces. | RFLP je časově náročný proces. |
| Použití primeru | |
| Používají se náhodné primery a stejné primery lze použít pro různé druhy. | Druhově specifické sondy se používají v RFLP pro hybridizaci. |
| Spolehlivost | |
| Spolehlivost techniky je ve srovnání s RFLP nižší. | RFLP je spolehlivá technika. |
| Blotování | |
| RAPD zahrnuje Southern blot. | Southern blotting je jedním krokem RFLP. |
| Detekce alelické variace | |
| Alelické variace nelze detekovat pomocí RAPD. | Alelické variace lze detekovat pomocí RFLP. |
| Potřeba sekvenčních znalostí | |
| RAPD nevyžaduje předchozí znalosti sekvence. | Pro návrh sondy je nutná předchozí znalost sekvence. |
| PCR | |
| PCR je zapojena do RAPD | PCR není zapojena do RFLP. |
| Reprodukovatelnost | |
| RAPD má nízkou reprodukovatelnost | RFLP má ve srovnání s RAPD vysokou reprodukovatelnost. |
Shrnutí - RAPD vs RFLP
RAPD a RFLP jsou důležité markery používané v molekulární biologii. Obě metody jsou schopné detekovat genetickou variabilitu mezi organismy. RAPD se provádí pomocí náhodných primerů. RFLP se provádí za použití specifických restrikčních enzymů. Obě metody vytvářejí profily DNA jedinečné pro jednotlivé organismy. RAPD zahrnuje poměrně málo kroků než RFLP. Ale produkuje méně spolehlivé a reprodukovatelné výsledky než RFLP. To je hlavní rozdíl mezi RAPD a RFLP.
