Klíčový rozdíl - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Nukleotidy jsou základní strukturální jednotky a stavební kameny DNA. Molekula DNA je složena z polynukleotidového řetězce. V DNA se nacházejí čtyři různé nukleotidy. Tyto nukleotidy se skládají ze čtyř různých dusíkatých bází pojmenovaných A (adenin), G (guanin), C (cytosin), T (thymin). Pořadí nukleotidů v molekule DNA má velký význam, protože kóduje důležitou genetickou informaci pro růst a vývoj organismů. Sekvenování DNA označuje proces, který určuje přesnou nukleotidovou sekvenci DNA. Existují různé metody sekvenování DNA. Sekvenování Maxam Gilbert a Sanger DNA sekvenování jsou dvě metody sekvenování DNA, které patří do sekvenování první generace. Postup sekvenování Maxam Gilbert určuje bazickou sekvenci chemickým štěpením 5 'konce značených fragmentů DNA přednostně na každém ze čtyř nukleotidů a gelovou elektroforézou. Procedura Sangerova sekvenování určuje nukleotidovou sekvenci syntetizací jednořetězcové DNA pomocí DNA polymerázy a dideoxynukleotidů a gelové elektroforézy. To je klíčový rozdíl mezi Maxam Gilbert a Sanger Sequencing.
OBSAH
1. Přehled a klíčový rozdíl
2. Co je Maxam Gilbert
3. Co je Sangerovo pořadí
4. Porovnání vedle sebe - Maxam Gilbert vs. Sangerovo pořadí
5. Shrnutí
Co je Maxam Gilbert Sequencing?
Sekvenování Maxam Gilbert, také známé jako metoda chemického sekvenování, je technika, která byla vyvinuta k určení pořadí nukleotidů v DNA. Tuto metodu představili Walter Gilbert a Alan Maxam v roce 1976 a stala se populární, protože ji lze provádět přímo s purifikovanou DNA. Metoda Maxama Gilberta patří k první generaci sekvenování DNA a byla to první metoda sekvenování, kterou vědci široce používají.
Základní princip této metody spočívá v omezení koncových značených fragmentů DNA na specifických bázích bázově specifickými chemikáliemi a podmínkami a separaci značených fragmentů elektroforézou, jak je znázorněno na obrázku 01. Fragmenty se dělí podle velikosti na gel. Protože jsou fragmenty značené, lze snadno odvodit sekvenci molekuly DNA.
Metoda Maxam Gilbert používá základní chemické látky k rozbití DNA na konkrétních bázích. K selektivnímu útoku na puriny a pyrimidiny se používají dvě běžné chemikálie s názvem dimethylsulfátové a hydrazinové chemikálie.
Metoda sekvenování Maxama Gilberta se provádí několika následujícími kroky.
- Čištění sekvence DNA pomocí restrikčních endonukleáz
- Značení konců fragmentů DNA přidáním radioaktivních fosfátů
- Čištění značených fragmentů z neznačených fragmentů gelovou elektroforézou
- Separace konce značené DNA do čtyř zkumavek a samostatné ošetření základními chemickými látkami
- Elektroforéza obsahu každé zkumavky na samostatných linkách na gelu a separace fragmentů podle jejich délky.
- Detekce fragmentů autoradiografem.
Obrázek 01: Sekvenování Maxama Gilberta
Co je Sangerovo sekvenování?
Sanger Sequencing je metoda sekvenování vyvinutá Frederickem Sangerem a jeho kolegy v roce 1977 k určení základní sekvence daného fragmentu DNA. Je také známá jako metoda sekvenování terminace řetězce nebo Dideoxy sekvenování. Tato metoda funguje na principu selektivní inkorporace dideoxynukleotidů ukončujících řetězec (ddNTP), jako jsou ddGTP, ddCTP, ddATP a ddTTP, pomocí DNA polymerázy během syntézy jednovláknové DNA k ukončení tvorby řetězce. Dideoxynukleotidy postrádají 3 'OH skupiny pro tvorbu fosfodiesterových vazeb se sousedním nukleotidem. Tvorba řetězce se proto zastaví, jakmile je ddNTP začleněn do nově se formujícího řetězce během sekvenování sangerů.
V této metodě se provádějí čtyři samostatné reakce syntézy DNA (PCR) ve čtyřech oddělených zkumavkách s jedním typem ddNTP. Další požadavky jsou také dodávány pro zkumavky pro PCR, včetně primerů, dNTP, Taq polymerázy, specifických podmínek atd. Čtyři oddělené reakce se provádějí ve čtyřech zkumavkách se čtyřmi směsmi. Po PCR reakcích jsou výsledné fragmenty DNA tepelně denaturovány a odděleny gelovou elektroforézou. Poté jsou fragmenty vizualizovány buď pomocí značeného (radioaktivního nebo fluorescenčního) primeru nebo dNTP, jak je znázorněno na obrázku 02.
Obrázek 02: Sekvenování podle Sangera
Jaký je rozdíl mezi Maxam Gilbert a Sanger Sequencing?
Rozdílný článek uprostřed před tabulkou
Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing |
|
| Sekvenování Maxam Gilbert je první technikou vyvinutou pro sekvenování DNA. | Metoda Sangerova sekvenování byla zavedena po metodě Maxam Gilberta. |
| Používání | |
| Tato metoda se používá jen zřídka. | Pro sekvenování se běžně používá Sangerovo sekvenování. |
| Používání nebezpečných chemikálií | |
| Používá nebezpečné chemikálie. | Použití nebezpečných chemikálií je ve srovnání s metodou Maxama Gilberta omezené. |
| Označení pro detekci | |
| Tato metoda používá radioaktivní P 32 pro označení konců fragmentů DNA. | Sangerovo sekvenování používá radioaktivně nebo fluorescenčně značené ddNTP. |
Shrnutí - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Maxam Gilbert a Sangerova sekvenování jsou dva typy technik sekvenování DNA, které spadají do sekvenování DNA první generace. Sekvenování Maxam Gilbert je první metodou zavedenou pro sekvenování DNA v roce 1976 a provádí se rozbitím koncových značených fragmentů DNA bázicky specifickými chemikáliemi. Proto je známé jako chemické sekvenování. Metoda Sangerova sekvenování byla zavedena v roce 1977 a je založena na ddNTP řízených řetězových terminačních reakcích. Metoda Sangerova sekvenování oblíbená než metoda Maxama Gilberta kvůli několika nevýhodám metody Maxama Gilberta, jako je nadměrná spotřeba času, používání nebezpečných chemikálií atd. To je rozdíl mezi sekvenováním Maxama Gilberta a Sangera.
