Klíčový rozdíl - Microarray vs RNA Sequencing
Transkriptom představuje celý obsah RNA přítomné v buňce, včetně mRNA, rRNA, tRNA, degradované RNA a nedegradované RNA. Profilování transkriptomu je důležitý proces, aby bylo možné porozumět poznatkům buněk. Existuje několik pokročilých metod profilování transkriptomů. Microarray a RNA sekvenování jsou dva typy technologií vyvinutých pro analýzu transkriptomu. Klíčovým rozdílem mezi sekvenováním microarray a RNA je, že microarray je založen na hybridizačním potenciálu předem určených značených sond s cílovými sekvencemi cDNA, zatímco RNA sekvenování je založeno na přímém sekvenování řetězců cDNA pomocí pokročilých technik sekvenování, jako je NGS. Microarray se provádí s předchozími znalostmi o sekvencích a sekvenování RNA se provádí bez předchozích znalostí o sekvencích.
OBSAH
1. Přehled a klíčový rozdíl
2. Co je Microarray
3. Co je sekvenování RNA
4. Porovnání vedle sebe - Microarray vs. RNA Sekvenování
5. Shrnutí
Co je Microarray?
Microarray je robustní, spolehlivá a vysoce propustná metoda používaná pro transkriptomové profilování vědci. Jedná se o nejpopulárnější přístup k analýze přepisů. Jedná se o nízkonákladovou metodu, která závisí na hybridizačních sondách.
Technika začíná extrakcí mRNA ze vzorku a konstrukcí knihovny cDNA z celkové RNA. Poté se smísí s fluorescenčně značenými předem navrženými sondami na pevném povrchu (bodová matice). Komplementární sekvence hybridizují se značenými sondami v microarray. Poté se mikročip promyje a promítá a obraz se kvantifikuje. Shromážděná data by měla být analyzována, aby se získaly profily relativních výrazů.
Intenzita mikročipových sond se považuje za úměrnou množství transkriptů ve vzorku. Přesnost techniky však závisí na navržených sondách, předchozí znalosti sekvence a afinitě sond k hybridizaci. Proto má technologie microarray omezení. Techniku Microarray nelze provést s přepisy s nízkou četností. Nedokáže rozlišit izoformy a identifikovat genetické varianty. Protože tato metoda závisí na hybridizaci sond, vyskytují se v mikroarray technice některé problémy související s hybridizací, jako je křížová hybridizace, nespecifická hybridizace atd.
Obrázek 01: Microarray
Co je to sekvenování RNA?
Sekvenování brokovnic RNA (RNA seq) je nedávno vyvinutá technika sekvenování celého transkriptomu. Je to rychlá a vysoce propustná metoda transkriptomového profilování. Přímo kvantifikuje expresi genů a vede k hlubokému výzkumu transkriptomu. RNA seq nezávisí na předem určených sondách nebo předchozí znalosti sekvencí. Proto má metoda RNA seq vysokou citlivost a schopnost detekovat nové geny a genetické varianty.
Metoda sekvenování RNA se provádí několika kroky. Celková RNA buňky musí být izolována a fragmentována. Poté pomocí reverzní transkriptázy musí být připravena cDNA knihovna. Každý řetězec cDNA musí být ligován s adaptéry. Poté musí být ligované fragmenty amplifikovány a purifikovány. Nakonec je třeba použít metodu NGS a provést sekvenování cDNA.
Obrázek 02: Sekvenování RNA
Jaký je rozdíl mezi Microarray a RNA sekvenováním?
Rozdílný článek uprostřed před tabulkou
Microarray vs RNA sekvenování |
|
| Microarray je robustní, spolehlivá a vysoce propustná metoda. | Sekvenování RNA je přesná a vysoce výkonná metoda. |
| Náklady | |
| Jedná se o nízkonákladovou metodu. | Toto je drahá metoda. |
| Analýza velkého počtu vzorků | |
| To usnadňuje analýzu velkého počtu vzorků současně. | To usnadňuje analýzu velkého počtu vzorků. |
| Analýza dat | |
| Analýza dat je složitá. | V této metodě se generuje více dat; proces je tedy složitější. |
| Předchozí znalost sekvencí | |
| Tato metoda je založena na hybridizačních sondách, takže je nutná předchozí znalost sekvencí. | Tato metoda nezávisí na předchozí znalosti sekvence. |
| Strukturální variace a nové geny | |
| Tato metoda nemůže detekovat strukturální variace a nové geny. | Tato metoda může detekovat strukturální variace, jako je fúze genů, alternativní sestřih a nové geny. |
| Citlivost | |
| To nemůže detekovat rozdíly v expresi izoforem, takže to má omezenou citlivost. | To má vysokou citlivost. |
| Výsledek | |
| To může mít za následek pouze relativní úrovně výrazu. To neposkytuje absolutní kvantifikaci genové exprese. | Poskytuje absolutní a relativní úrovně vyjádření. |
| Analýza dat | |
| To je třeba znovu spustit, aby bylo možné znovu provést analýzu. | Sekvenční data lze reanalyzovat. |
| Potřeba konkrétního personálu a infrastruktury | |
| Pro microarray není vyžadována specifická infrastruktura a personál. | Specifická infrastruktura a personál vyžadovaný sekvenováním RNA. |
| Technické problémy | |
| Technika microarray má technické problémy, jako je křížová hybridizace, nespecifická hybridizace, omezená míra detekce jednotlivých sond atd. | Technika RNA seq se vyhýbá technickým problémům, jako je křížová hybridizace, nespecifická hybridizace, omezená míra detekce jednotlivých sond atd. |
| Předsudky | |
| Toto je zaujatá metoda, protože závisí na hybridizaci. | Předpětí je ve srovnání s microarray nízké. |
Shrnutí - Microarray vs RNA Sequencing
Metody microarray a RNA jsou vysoce výkonné platformy vyvinuté pro profilování transkriptomů. Obě metody poskytují výsledky, které vysoce korelují s profily genové exprese. Sekvenování RNA má však pro analýzu genové exprese výhody oproti microarray. Sekvenování RNA je citlivější metodou pro detekci transkriptů s nízkou četností než microarray. Sekvenování RNA také umožňuje rozlišení mezi izoformami a identifikaci genových variant. Microarray je však běžnou volbou většiny výzkumníků, protože sekvenování RNA je nová a nákladná technika s výzvami pro ukládání dat a komplexní analýzou dat.
