Klíčový rozdíl - Sangerovo sekvenování vs. pyrosekvenování
Sekvenování DNA je pro analýzu DNA velmi důležité, protože znalost správného uspořádání nukleotidů v konkrétní oblasti DNA o ní odhaluje mnoho důležitých informací. Existují různé metody sekvenování DNA. Sangerovo sekvenování a pyrosekvenování jsou dvě různé metody sekvenování DNA široce používané v molekulární biologii. Klíčovým rozdílem mezi Sangerovým sekvenováním a pyrosekvenováním je, že Sangerovo sekvenování používá dideoxynukleotidy k ukončení syntézy DNA ke čtení nukleotidové sekvence, zatímco pyrosekvenování detekuje uvolnění pyrofosfátu začleněním nukleotidů a syntetizováním komplementární sekvence ke čtení přesného pořadí sekvence.
OBSAH
1. Přehled a klíčový rozdíl
2. Co je to Sangerovo sekvenování
3. Co je to pyrosekvenování
4. Porovnání vedle sebe - Sangerovo sekvenování vs. pyrosekvenování
5. Shrnutí
Co je Sangerovo sekvenování?
Sangerovo sekvenování je metoda generování DNA první generace vyvinutá Frederickem Sangerem a jeho vysokými školami v roce 1977. Je také známá jako sekvenování řetězového ukončení nebo dideoxyové sekvenování, protože je založena na terminaci řetězce dideoxynukleotidy (ddNTP). Tato metoda byla široce používána více než 30 let, dokud nebylo vyvinuto sekvenování nové generace (NGS). Technika Sangerova sekvenování umožnila objevení správného pořadí nukleotidů nebo připojení konkrétního fragmentu DNA. Je založen na selektivním zabudování ddNTP a ukončení syntézy DNA během replikace DNA in vitro. Absence 3 'OH skupin pro pokračování tvorby fosfodiesterové vazby mezi sousedními nukleotidy je jedinečnou vlastností ddNTP. Jakmile je tedy ddNTP připojen, prodlužování řetězce přestane a od tohoto bodu skončí. V Sangerově sekvenování jsou použity čtyři ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP a ddTTP. Tyto nukleotidy zastavují proces replikace DNA, když jsou začleněny do rostoucího řetězce DNA, a mají za následek různé délky krátké DNA. K uspořádání těchto krátkých řetězců DNA podle jejich velikostí na gelu se používá kapilární gelová elektroforéza, jak je znázorněno na obrázku 01.
Obrázek 1: Elektroforéza kapilárního gelu syntetizované krátké DNA
Pro replikaci DNA in vitro by mělo být stanoveno několik požadavků. Jsou to enzym DNA polymeráza, templátová DNA, oligonukleotidové primery a deoxynukleotidy (dNTP). V Sangerově sekvenování se replikace DNA provádí ve čtyřech samostatných zkumavkách spolu se čtyřmi typy ddNTP samostatně. Deoxynukleotidy nejsou zcela nahrazeny příslušnými ddNTP. Směs konkrétního dNTP (například; dATP + ddATP) je zahrnuta do zkumavky a replikována. Čtyři samostatné zkumavkové produkty se nanesou na gel ve čtyřech samostatných jamkách. Poté čtením gelu lze sekvenci zkonstruovat, jak je znázorněno na obrázku 02.
Obrázek 02: Sangerovo sekvenování
Sangerovo sekvenování je důležitá technika, která pomáhá v mnoha oblastech molekulární biologie. Projekt lidského genomu byl úspěšně dokončen pomocí metod založených na Sangerově sekvenování. Sekvenování podle Sangera je také užitečné při sekvenování cílové DNA, výzkumu rakoviny a genetických chorob, analýze genové exprese, identifikaci člověka, detekci patogenů, mikrobiálním sekvenování atd.
Existuje několik nevýhod Sangerova sekvenování:
- Délka sekvenované DNA nemůže být delší než 1000 párů bází
- Sekvenovat lze najednou pouze jeden řetězec.
- Tento proces je časově náročný a nákladný.
Proto byly vyvinuty nové pokročilé techniky sekvenování s časem k překonání těchto problémů. Sangerovo sekvenování se však stále používá kvůli jeho vysoce přesným výsledkům až do fragmentů délky přibližně 850 párů bází.
Co je pyrosekvenování?
Pyrosekvenování je nová technika sekvenování DNA založená na „sekvenování syntézou“. Tato technika se spoléhá na detekci uvolňování pyrofosfátu po začlenění nukleotidů. Proces je využíván čtyřmi různými enzymy: DNA polymerse, ATP sulfurylázou, luciferázou a apyrázou a dvěma substráty adenosin 5 'fosfosulfátem (APS) a luciferinem.
Proces začíná vazbou primeru s jednořetězcovým DNA templátem a DNA polymeráza zahájí inkorporaci nukleotidů, které jsou k němu komplementární. Když se nukleotidy spojí dohromady (polymerace nukleových kyselin), uvolní pyrofosfátové (dvě vázané fosfátové skupiny) skupiny a energii. Každé přidání nukleotidů uvolňuje ekvimolární množství pyrofosfátu. Pyrofosfát se převádí na ATP pomocí ATP sulfurylázy v přítomnosti substrátu APS. Generovaný ATP řídí luciferázou zprostředkovanou konverzi luciferinu na oxyluciferin a produkuje viditelné světlo v množství, které je úměrné množství ATP. Světlo je detekováno fotonovým detekčním zařízením nebo fotonásobičem a vytváří pyrogram. Apyráza degraduje ATP a neinkorporované dNTP v reakční směsi. Přidání dNTP se provádí najednou. Protože přidání nukleotidu je známé podle inkorporace a detekce světla, lze určit sekvenci templátu. Pyrogram se používá ke generování nukleotidové sekvence vzorku DNA, jak je znázorněno na obrázku 03.
Pyrosekvenování je velmi důležité při analýze polymorfismu jednoho nukleotidu a sekvenování krátkých úseků DNA. Vysoká přesnost, flexibilita, snadnost automatizace a paralelní zpracování jsou výhodami pyrosekvenování oproti Sangerovým sekvenčním technikám.
Obrázek 03: Pyrosekvenování
Jaký je rozdíl mezi Sangerovým sekvenováním a pyrosekvenováním?
Rozdílný článek uprostřed před tabulkou
Sangerovo sekvenování vs. pyrosekvenování |
|
| Sangerovo sekvenování je metoda sekvenování DNA založená na selektivní inkorporaci ddNTP pomocí DNA polymerázy a ukončení řetězce. | Pyrosekvenování je metoda sekvenování DNA založená na detekci uvolňování pyrofosfátu po začlenění nukleotidu. |
| Použití ddNTP | |
| ddNTP se používají k ukončení replikace DNA | ddNTP se nepoužívají. |
| Enzymy jsou zapojeny | |
| Používá se DNA polymeráza. | Používají se čtyři enzymy: DNA polymeráza, ATP sulfuryláza, luciferáza a apyráza. |
| Použité substráty | |
| APS a Luciferin se nepoužívají. | Používá se adenosin 5 'fosfosulfát (APS) a luciferin. |
| Maximální teplota | |
| Toto je pomalý proces. | Toto je rychlý proces. |
Shrnutí - Sangerovo sekvenování vs. pyrosekvenování
Sangerovo sekvenování a pyrosekvenování jsou dvě metody sekvenování DNA používané v molekulární biologii. Sangerovo sekvenování konstruuje pořadí nukleotidů v sekvenci ukončením prodloužení řetězce, zatímco pyrosekvenování konstruuje přesné pořadí nukleotidů v sekvenci začleněním nukleotidů a detekcí uvolňování pyrofosfátů. Proto hlavní rozdíl mezi Sangerovým sekvenováním a pyrosekvenováním spočívá v tom, že Sangerovo sekvenování funguje na sekvenování zakončením řetězce, zatímco pyrosekvenování funguje na sekvenování syntézou.
