Klíčový rozdíl - NGS vs Sangerovo sekvenování
Next Generation Sequencing (NGS) a Sanger Sequencing jsou dva typy technik sekvenování nukleotidů vyvinutých v průběhu času. Metoda Sangerova sekvenování byla široce používána po mnoho let a NGS ji nedávno nahradila kvůli svým výhodám. Klíčovým rozdílem mezi NGS a Sangerovým sekvenováním je to, že NGS pracuje na principu sekvenování milionů sekvencí současně rychlým způsobem prostřednictvím sekvenčního systému, zatímco Sangerovo sekvenování funguje na principu ukončení řetězce díky selektivnímu zabudování dideoxynukleotidů enzymem DNA polymeráza. během replikace DNA a výsledné separace fragmentů kapilární elektroforézou.
OBSAH
1. Přehled a klíčový rozdíl
2. Co je nukleotidové sekvenování
3. Co je NGS
4. Co je Sangerovo sekvenování
5. Porovnání vedle sebe - NGS vs. Sangerovo sekvenování
6. Shrnutí
Co je sekvenování nukleotidů?
Genetická informace je uložena v nukleotidových sekvencích DNA nebo RNA organismu. Proces určování správného pořadí nukleotidů (pomocí čtyř bází) v daném fragmentu (v genu, klastru genů, chromozomu a úplném genomu) je znám jako nukleotidové sekvenování. V genomických studiích, forenzních studiích, virologii, biologické systematické, lékařské diagnostice, biotechnologii a v mnoha dalších oblastech je velmi důležité analyzovat strukturu a funkci genů. Vědci vyvíjejí různé typy sekvenčních metod. Mezi nimi bylo široce používáno a dlouhodobě popularizováno Sangerovo sekvenování vyvinuté Frederickem Sangerem v roce 1977, dokud jej nenahradilo sekvenování nové generace.
Co je NGS?
Next Generation Sequencing (NGS) je termín používaný k označení moderních vysoce výkonných sekvenčních procesů. Popisuje řadu různých moderních technologií sekvenování, které přinesly revoluci v genomických studiích a molekulární biologii. Těmito technikami jsou sekvenování Illumina, sekvenování Roche 454, sekvenování iontových protonů a sekvenování SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation Detection). Systémy NGS jsou rychlejší a levnější. V systémech NGS se používají čtyři hlavní metody sekvenování DNA; pyrosekvenování, sekvenování syntézou, sekvenování ligací a iontové polovodičové sekvenování. Paralelně lze sekvenovat velké množství řetězců DNA nebo RNA (miliony). Umožňuje sekvenování celého genomu organismů v krátkém časovém období, na rozdíl od Sangerova sekvenování, které trvá déle.
NGS má oproti konvenční Sangerově metodě mnoho výhod. Jedná se o vysokorychlostní, přesnější a nákladově efektivnější proces, který lze provést s malou velikostí vzorku. NGS lze použít v metagenomických studiích, při detekci variací v jednotlivých genomech v důsledku inzercí a delecí atd. A při analýze genových expresí.
Obrázek_1: Vývoj v sekvenování NGS
Co je Sangerovo sekvenování?
Sanger Sequencing je metoda sekvenování vyvinutá Frederickem Sangerem a jeho kolegy v roce 1977 k určení přesného pořadí nukleotidů daného fragmentu DNA. To je také známé jako sekvenční ukončení řetězce nebo Dideoxy sekvenování. Funkčním principem této metody je ukončení syntézy řetězce selektivním začleněním dideoxynukleotidů (ddNTP) ukončujících řetězec, jako jsou ddGTP, ddCTP, ddATP a ddTTP, pomocí DNA polymerázy během replikace DNA. Normální nukleotidy mají 3 'OH skupiny pro tvorbu fosfodiesterové vazby mezi sousedními nukleotidy, aby pokračovaly ve tvorbě řetězce. Avšak ddNTP chybí tato 3 'OH skupina a nejsou schopny tvořit fosfodiesterové vazby mezi nukleotidy. Prodloužení řetězce je proto ukončeno.
V této metodě slouží jednořetězcová DNA, která má být sekvenována, jako templátové vlákno pro syntézu DNA in vitro. Dalšími požadavky jsou oligonukleotidový primer, prekurzory deoxynukleotidů a enzym DNA polymeráza. Jsou-li známy sousední konce cílového fragmentu, lze snadno navrhnout primery pro replikaci DNA. Čtyři samostatné reakce syntézy DNA se provádějí ve čtyřech oddělených zkumavkách. Každá zkumavka má samostatné ddNTP, spolu s dalšími požadavky. Z konkrétního nukleotidu se přidá směs dNTP a ddNTP. Podobně se provádějí čtyři oddělené reakce ve čtyřech zkumavkách se čtyřmi směsmi. Po reakcích se provádí detekce fragmentů DNA a konverze vzorců fragmentů na informace o sekvenci. Výsledné fragmenty DNA jsou tepelně denaturovány a odděleny gelovou elektroforézou. Pokud se použijí radioaktivní nukleotidy, pruhování v polyakrylamidovém gelu lze vizualizovat autoradiografií. Když tato metoda používá fluorescenčně značené dideoxynukleotidy, může být zmírněna načtením gelu a prošel paprskem laseru, aby byl detekován fluorescenčním detektorem. Aby se zabránilo chybám, které mohou nastat, když je sekvence přečtena okem a zadána ručně do počítače, vyvinula se tato metoda v použití automatizovaného sekvenceru spojeného s počítačem. Aby se zabránilo chybám, které mohou nastat, když je sekvence přečtena okem a zadána ručně do počítače, vyvinula se tato metoda v použití automatizovaného sekvenceru spojeného s počítačem. Aby se zabránilo chybám, které mohou nastat, když je sekvence přečtena okem a zadána ručně do počítače, vyvinula se tato metoda v použití automatizovaného sekvenceru spojeného s počítačem.
Toto je metoda používaná k sekvenování DNA z projektu Human Genome. Tato metoda se stále používá s pokročilými úpravami, protože poskytuje přesné informace o sekvenci, přestože je drahý a pomalý proces.
Obrázek_2: Sekvenování podle Sangera
Jaký je rozdíl mezi NGS a Sangerovým sekvenováním?
Rozdílný článek uprostřed před tabulkou
NGS vs Sangerovo sekvenování |
|
| Next Generation Sequencing (NGS) odkazují na moderní vysoce výkonné sekvenční procesy. Popisuje řadu různých moderních technologií sekvenování | Sangerovo sekvenování je metoda sekvenování vyvinutá Frederickem Sangerem k určení přesného pořadí nukleotidů daného fragmentu DNA. |
| Efektivita nákladů | |
| NGS je levnější proces, protože snižuje čas, lidskou sílu a chemikálie. | Jedná se o nákladný proces, protože to vyžaduje čas, lidskou sílu a více chemikálií. |
| Rychlost | |
| To je rychlejší, protože jak chemická detekce, tak detekce signálu mnoha řetězců probíhají paralelně. | To je časově náročné, protože chemická detekce a detekce signálu probíhá jako dva samostatné procesy a pouze na vlákně lze číst najednou. |
| Spolehlivost | |
| NGS je spolehlivá. | Sangerovo řazení je méně spolehlivé |
| Velikost vzorku | |
| NGS vyžaduje menší množství DNA. | Tato metoda vyžaduje velké množství templátové DNA. |
| Báze DNA na sekvenovaný fragment | |
| Počet bází DNA na sekvenovaný fragment je nižší než Sangerova metoda | Generující sekvence jsou delší než sekvence NGS. |
Shrnutí - NGS vs Sangerovo sekvenování
NGS a Sangerovo sekvenování jsou techniky sekvenování nukleotidů široce využívané v molekulární biologii. Sangerovo sekvenování je metoda časného sekvenování, která byla nahrazena NGS. Hlavní rozdíl mezi NGS a Sangerovým sekvenováním spočívá v tom, že NGS je vysokorychlostní, přesnější a nákladově efektivnější proces než Sangerovo sekvenování. Obě techniky vytvořily hlavní ohniska v genetice a biotechnologii.
