PCR vs PCR v reálném čase
PCR nebo polymerázová řetězová reakce je převratný objev v moderní molekulární biologii, který byl poprvé vyvinut chemikem Kary Mullisem v roce 1983. Umožňuje amplifikaci jedné sekvence ve složité DNA pro analýzu. Základní myšlenkou PCR je, že dva primery, které jsou komplementární k opačným řetězcům sekvence DNA, jsou orientovány proti sobě; primery produkují komplementární řetězce, z nichž každý obsahuje druhý primer. Výsledkem je tedy velké množství sekvence odpovídající DNA, která leží mezi dvěma primery. Enzym DNA polymerázy se používá k prodloužení primerů v PCR. DNA polymeráza je termostabilní enzym a má schopnost přežít při vysokých teplotách (94 až 95 ° C) používaných k denaturaci templátové DNA.
PCR zahrnuje tři kroky, a to opakované cykly denaturace, hybridizace primerů a syntéza DNA. K provedení této reakce se používá termocykler, aby bylo možné naprogramovat rychlou a přesnou změnu teploty. Aplikace PCR jsou vyšetřování trestných činů, otisky prstů DNA, detekce patogenů a analýza DNA raných lidských druhů.
Co je konvenční PCR?
Existují tři hlavní fáze konvenční PCR, jmenovitě; Fáze amplifikace DNA, separace PCR a detekce produktů. Oddělení segmentů DNA se obvykle provádí elektroforézou na agarózovém gelu. Produkty se poté obarví etheiduimbromidem. Nakonec se detekce dosáhne vizualizací pásů na gely pod UV zářením. Konečné výsledky konvenční PCR proto nejsou vyjádřeny jako čísla. Obvykle je konvenční PCR schopna detekovat pouze jeden parametr.
Co je to real-time PCR?
PCR v reálném čase dokáže detekovat amplifikaci produktů, protože produkty jsou syntetizovány. S rozvojem technologie se PCR stala velmi populární technikou, zejména pro detekci a identifikaci bakterií v potravinách. PCR v reálném čase používá systém fluorescenčních barviv a termocykler vybavený schopností detekce fluorescence.
Jaký je rozdíl mezi konvenční PCR a PCR v reálném čase?
• Konvenční PCR je časově náročnější, protože k analýze amplifikovaných produktů PCR používá gelovou elektroforézu. Naproti tomu PCR v reálném čase je méně časově náročná, protože dokáže detekovat amplifikace během raných fází reakce.
• PCR v reálném čase sbírá data ve fázi exponenciálního růstu PCR, zatímco tradiční PCR sbírá data v koncovém bodě reakce.
• Výsledky koncového bodu konvenční PCR nemusí být velmi přesné, ale výsledky PCR v reálném čase jsou velmi přesné.
• PCR v reálném čase je citlivější než konvenční PCR.
• Konvenční PCR má velmi špatné rozlišení, zatímco PCR v reálném čase dokáže detekovat velmi malé změny kvůli vysokému rozlišení.
• Detekce koncového bodu konvenční PCR má krátký dynamický rozsah, zatímco detekce PCR v reálném čase má široký dynamický rozsah.
• Na rozdíl od konvenční PCR se v PCR v reálném čase nacházejí techniky automatické detekce.
• Konvenční PCR je vysoce sofistikovaná a náročnější na práci než PCR v reálném čase.
• Na rozdíl od PCR v reálném čase nemůže konvenční PCR rozlišovat mezi mrtvými a živými bakteriemi.
• PCR v reálném čase používá k detekci produktů systém fluorescenčních barviv, zatímco konvenční PCR používá k vizualizaci pásů v agarózovém gelovém médiu ethidiumbromid a UV světlo.
