Klíčový rozdíl - PCR primery vs sekvenční primery
S nedávným vývojem v oblasti molekulární biologie byly vyvinuty různé genetické techniky, díky nimž byly vyšetřovací procesy různých cest subjektu snadné a přesné. PCR a další sekvenční postupy jsou dvě důležité takové techniky. Používají různé dílčí komponenty. Primery jsou považovány za hlavní dílčí složku společnou jak pro PCR, tak pro techniky sekvenování. PCR primery se používají pro amplifikaci konkrétní sekvence DNA, zatímco sekvenční primery se používají v kontextu sekvenování fragmentu DNA se záměrem odhalit jeho specifické pořadí nukleotidové sekvence. Toto je klíčový rozdíl mezi primery PCR a sekvenčními primery.
OBSAH
1. Přehled a klíčový rozdíl
2. Co jsou primery PCR
3. Co jsou sekvenační primery
4. Podobnosti mezi PCR primery a sekvenčními primery
5. Porovnání vedle sebe - PCR primery vs. sekvenční primery ve formě tabulky
6. Shrnutí
Co jsou PCR primery?
Polymerázová řetězová reakce (PCR) je genetická technika, která se využívá v oblasti molekulární biologie k amplifikaci jedné nebo několika kopií konkrétního segmentu DNA a k získání mnoha milionů identických kopií. V PCR reakci se používají různé složky včetně primerů. Primery jsou krátké řetězce DNA s délkou nukleotidů 18-25, díky čemuž jsou kompatibilní s počáteční a koncovou oblastí fragmentů DNA, které mají být amplifikovány. Primery mohou být přední a reverzní primer. Tyto primery se vážou na fragment DNA ve specifických bodech, kde se DNA polymeráza váže na specifický primer v místě a iniciuje syntézu nového řetězce DNA.
Výběr primerů je důležitým aspektem procesu PCR. Výběr délky základního nátěru je důležitý. Ideální délka by byla 18-25 nukleotidů. Pokud je délka příliš krátká nebo příliš dlouhá, primery se neváží na sekvenci DNA, aby byly přesně amplifikovány. Příliš krátké délky primerů vede k nespecifickému nasedání primeru na různých místech sekvence DNA.
Obrázek 01: PCR primery
Obsah guaninu a cytosinu (GC) v dobrém základním nátěru by měl být v rozmezí 40-60. Teplota žíhání primeru a teplota tání jsou zásadní faktory během PCR. Teplota tání musí být přesně vypočíst, a primer žíhací teplota by měla být 5 0 C nižší než je teplota tání. Teplota tání by měla být 60 ° C a 75 ° C. Příliš vysoké nebo příliš nízké teploty budou mít za následek méně aktivní aktivity DNA polymerázy.
Co jsou to sekvenční primery?
Sekvenční primery se používají v kontextu sekvenování fragmentu DNA se záměrem odhalit jeho specifickou identitu. Pro získání dobrých výsledků sekvenování jsou důležité vysoce kvalitní primery a šablony. Když jsou tedy vybrány primery, měly by být jedinečné pro konkrétní oblast, kde chceme sekvenovat. Mělo by to být také se správnou orientací, kde jsou sekvence obvykle generovány od 3 'do 5' konců primerů. Sekvence by měla postrádat nežádoucí samohybridizaci, jako je tvorba vlásenkových smyček. Neměl by obsahovat postupnou tvorbu guaninových bází.
Teplota tání (Tm) primeru musí být vhodná pro podmínky sekvenování. Proto by měla ležet mezi 52 ° C a 74 ° C. Příprava oligonukleotidů, které mají být použity jako primer, by měla být purifikována, aby se získala požadovaná celá délka sekvence. Pokud oligonukleotidy obsahují nečistoty, signalizace sekvence primeru bude superponována z různých míst primingu a také to sníží počet bazických buněk.
Obrázek 02: Sekvenční primery
Teplota tání primeru (Tm) oligonukleotidu určuje, jak silné jsou navzájem hybridizovány komplementární řetězce DNA. Tm lze považovat za termodynamický výpočet, kde závisí na obou sekvencích DNA a několika podmínkách, jako je koncentrace soli. Tm je důležitý během PCR, kde se k produkci skupiny fragmentů zakončených dideoxynukleotidem používá varianta nazývaná sekvenování cyklu. Zde bude primer, který je sekvenován, zpočátku alternativně žíhán, poté prodloužen a nakonec denaturován pro amplifikaci. Proto by hodnota Tm měla být mezi 52 o C a 74 oC. Syntetizované oligonukleotidy mohou být získány z laboratoří syntézy DNA / RNA podle výběru. Malý rozsah syntézy, který se používá pro sekvenování DNA, je obvykle 50 nmol. A co je nejdůležitější, primery použité pro sekvenování by měly být čištěny tak, aby neobsahovaly nečistoty, které zabrání snížení kvality.
Jaké jsou podobnosti mezi PCR primery a sekvenčními primery?
- Oba primery PCR a sekvenční primery jsou primery, které se používají v procesu amplifikace cílové sekvence DNA.
- PCR primery i sekvenční primery jsou složeny z nukleotidů.
- Jak PCR primery, tak sekvenční primery jsou krátké oligomery.
Jaký je rozdíl mezi primery PCR a sekvenčními primery?
Rozdílný článek uprostřed před tabulkou
PCR primery vs sekvenční primery |
|
| PCR primery jsou krátké řetězce DNA s délkou nukleotidové sekvence 18-25, takže jsou kompatibilní s počáteční a koncovou oblastí fragmentů DNA, které mají být amplifikovány. | Sekvenční primery jsou krátké oligomery, které se používají v souvislosti se sekvenováním fragmentu DNA se záměrem odhalit jeho specifickou identitu. |
| Funkce | |
| PCR primery se používají pro amplifikaci konkrétní sekvence DNA. | Sekvenční primery se používají v kontextu sekvenování fragmentu DNA se záměrem odhalit jeho specifickou identitu. |
| Počet potřebných primerů | |
| Dva primery; jeden přímý primer a jeden reverzní primer se používají jako primery PCR. | Potřebujete pouze jeden primer jako sekvenční primer. |
Shrnutí - PCR primery vs sekvenční primery
Sekvenční primery se používají v kontextu sekvenování fragmentu DNA se záměrem odhalit jeho specifickou identitu. Ke spuštění procesu bude stačit jeden sekvenční primer. Pro získání dobrých výsledků sekvenování jsou důležité vysoce kvalitní primery a šablony. Když jsou tedy vybrány primery, měly by být jedinečné pro konkrétní oblast, kde chceme sekvenovat. PCR primery jsou krátké řetězce DNA s délkou nukleotidu 18-25, která je kompatibilní s počáteční a koncovou oblastí fragmentů DNA, které mají být amplifikovány. PCR primery mohou být přímý primer a reverzní primer. Obsah guaninu a cytosinu (GC) v dobrém základním nátěru by měl být v rozmezí 40-60. Teplota žíhání primeru a teplota tání jsou zásadní aspekty během PCR. To je rozdíl mezi primery PCR a sekvenčními primery.
