Klíčový rozdíl - PCR vs DNA sekvenování
PCR a sekvenování DNA jsou dvě důležité techniky v molekulární biologii. Polymerázová řetězová reakce (PCR) je proces, který vytváří velké množství kopií fragmentu DNA. Sekvenování DNA je technika, která vede k přesnému pořadí nukleotidů daného fragmentu DNA. To je klíčový rozdíl mezi sekvenováním PCR a DNA. PCR je jedním z hlavních kroků při sekvenování DNA.
OBSAH
1. Přehled a klíčový rozdíl
2. Co je to PCR
3. Co je to sekvenování DNA
4. Porovnání vedle sebe - PCR vs. sekvenování DNA
5. Shrnutí
Co je to PCR?
Polymerázová řetězová reakce (PCR) je technika amplifikace DNA používaná v molekulární biologii. Produkuje tisíce až miliony kopií konkrétního fragmentu DNA. Tuto metodu vyvinul Kary Mullis v roce 1983. V této technice slouží fragment DNA, který má být amplifikován, jako templát a enzym DNA polymeráza přidává komplementární nukleotidy k primeru, který je k dispozici ve směsi PCR. Na konci PCR reakce je syntetizováno mnoho kopií vzorku DNA.
Existují různé složky směsi PCR, včetně DNA, DNA polymerázy (Taq polymerázy), primerů (přímé a reverzní primery), nukleotidů (stavební bloky DNA) a pufru. PCR probíhá uvnitř přístroje PCR a do přístroje by měla být zavedena správná směs PCR a měl by být zaveden správný program. Tato technika umožňuje produkci tisíců až milionů kopií určité části DNA z velmi malého množství DNA.
PCR reakce probíhají cyklicky a vytvářejí viditelné množství produktů PCR na gelu. Do reakce PCR jsou zahrnuty tři hlavní kroky, jmenovitě denaturace, žíhání primeru a prodloužení řetězce, jak je znázorněno na obrázku 01. Tyto tři kroky probíhají při třech různých teplotách. DNA existuje ve dvouřetězcové formě vodíkovými vazbami mezi komplementárními bázemi. Před implikací by měla být dvouvláknová DNA od sebe oddělena. To se provádí vysokou teplotou. Při vysoké teplotě se dvouvláknová DNA denaturovala na jednořetězce. Pak by se primery měly přiblížit k sousedícím koncům specifického fragmentu nebo genu DNA. Primer je krátký kousek jednovláknové DNA, který je komplementární k cílové sekvenci. Forwardové a reverzní primery hybridizují s komplementárními bázemi na přilehlých koncích denaturované vzorky DNA při teplotě hybridizace. Základní nátěry by měly být odolné vůči teplu. Jakmile primery hybridizují se vzorkem DNA, zahájí enzym taq polymeráza syntézu nových řetězců přidáním nukleotidů, které jsou komplementární k cílové DNA. Taq polymeráza je tepelně stabilní enzym izolovaný z termofilní bakterie zvané Thermus aquaticus. Pufr PCR udržuje optimální podmínky pro působení taq polymerázy. Tyto tři fáze PCR reakcí se opakují, aby se získalo požadované množství produktu PCR. Po každé PCR reakci se počet kopií DNA zdvojnásobí. Proto lze v PCR pozorovat exponenciální zesílení. Produkty PCR lze pozorovat pomocí gelové elektroforézy a lze je čistit pro další studie.
Obrázek 01: Hlavní kroky reakce PCR
PCR je cenným nástrojem v lékařském a biologickém výzkumu. PCR má ve forenzní vědě zvláštní hodnotu, protože může amplifikovat DNA pro studie z drobných vzorků od zločinců a vytvářet forenzní profily DNA. PCR se široce používá v mnoha oblastech molekulární biologie, včetně genotypizace, genového klonování, detekce mutací, sekvenování DNA, DNA mikročipů a testování otcovství atd.
Obrázek 02: Polymerázová řetězová reakce
Co je to sekvenování DNA?
Sekvenování DNA je stanovení přesného pořadí nukleotidů - adeninu, guaninu, cytosinu a thyminu v daném fragmentu DNA. Genetická informace se ukládá do sekvencí DNA ve správném pořadí nukleotidů. Nalezení přesného pořadí nukleotidů ve fragmentu DNA je tedy velmi důležité vědět o struktuře a funkci genů.
Protokol sekvenování DNA zahrnuje různé procesy. Prvním krokem je izolace zainteresované DNA nebo genomové DNA organismu. Použitím PCR (jak je popsáno výše) by měla být amplifikována požadovaná oblast DNA. Amplifikovaný produkt PCR by měl být oddělen gelovou elektroforézou a purifikován. Zesílené fragmenty se slouží jako šablony pro sekvenování. Sekvenování lze provést buď pomocí Sangerova sekvenování, nebo metodou vysoce výkonného sekvenování. Sangerovo sekvenování vyžaduje kapilární elektroforézu výsledných fragmentů DNA. Stanovení správného pořadí nukleotidů lze provést manuálním odečtem autoradiografů nebo pomocí automatických sekvencerů DNA.
Sekvenování genů přispělo k projektu lidského genomu a usnadnilo mapování lidského genomu v roce 2003. Ve forenzní oblasti umožnilo sekvenování DNA identifikaci osob, které vykazují jedinečné sekvence DNA a identifikují zločince. V medicíně lze sekvenování DNA použít k detekci genů odpovědných za genetická a jiná onemocnění, k nalezení defektních genů a jejich nahrazení správnými geny. V zemědělství se informace o sekvenování DNA některých mikroorganismů používají k produkci transgenních plodin s ekonomicky požadovanými vlastnostmi.
Obrázek 03: Sekvenování DNA
Jaký je rozdíl mezi sekvenováním PCR a DNA?
Rozdílný článek uprostřed před tabulkou
Sekvenování PCR vs DNA |
|
| Proces PCR vytváří tisíce až miliony kopií zainteresovaného fragmentu DNA. | Sekvenování DNA je proces určování přesného pořadí nukleotidů v daném fragmentu DNA. |
| Výsledek | |
| PCR vytváří tisíce až miliony kopií konkrétního fragmentu DNA | To vede ke správnému pořadí bází v konkrétním fragmentu DNA. |
| Zapojení ddNTP | |
| PCR nevyžaduje ddNTP. Používá dNTP. | Sekvenování DNA vyžaduje k ukončení tvorby řetězce ddNTP. |
Shrnutí - PCR vs DNA sekvenování
PCR a sekvenování DNA jsou velmi důležitými nástroji v mnoha oblastech molekulární biologie. Amplifikace fragmentů DNA se provádí technikou PCR, zatímco správné pořadí nukleotidů fragmentu DNA se stanoví sekvenováním DNA. To je rozdíl mezi sekvenováním PCR a DNA.
