Klíčový rozdíl - klonování vs. subklonování
Klonování a subklonování jsou molekulárně biologické postupy, které vytvářejí geneticky identické buňky nebo organismy nesoucí DNA nebo gen, které jsou předmětem zájmu. Klonování je technika, která zahrnuje vložení požadovaného genu nebo DNA do vektoru, jeho replikaci v hostitelské bakterii a produkci buněk nebo organismů, které jsou přesnou kopií genetického složení. Subklonování je technika, která zahrnuje inzerci požadovaného genu, který je již vložen do vektoru, do sekundárního vektoru, jeho replikaci v hostitelské bakterii a produkci geneticky identických kopií buněk nebo organismů. Klíčovým rozdílem mezi klonováním a subklonováním je to, že při klonování požadovaný gen, jakmile je ligován do vektoru, pokračuje v klonovacím procesu, zatímco v subklonováníjiž klonovaný požadovaný gen je oddělen od rodičovského vektoru a znovu vložen do vektoru příjemce a pokračovat v procesu.
OBSAH
1. Přehled a klíčový rozdíl
2. Co je klonování
3. Co je subklonování
4. Porovnání vedle sebe - klonování vs. subklonování
5. Shrnutí
Co je to klonování?
Klonování je postup, při kterém se produkují geneticky identické organismy nebo buňky. V přírodě se klonování děje prostředky nepohlavního rozmnožování. Pokud nedojde k žádné genetické rekombinaci nebo změně, dceřiné buňky dostanou stejnou genetickou výbavu jako rodič. Prokaryotické a eukaryotické organismy vytvářejí klony binárním štěpením, pučením, mitózou atd. V molekulární biologii je klonování genů nebo specifických fragmentů DNA populární metodou ke studiu struktury a funkce této konkrétní části DNA.
Hlavním cílem molekulárního klonování je pořídit miliony kopií geneticky identických buněk nebo organismů nesoucích požadovaný fragment DNA (hlavně geny). Vytváří organismy s přesnými genetickými kopiemi jiného. Specifické geny jsou primárně klonovány v molekulárních studiích za účelem získání strukturních a funkčních informací a pro sekvenování DNA. Klonování je také široce používáno pro produkci specifických proteinů nebo produktů ve velkém měřítku.
Postup klonování
Základní kroky postupu klonování jsou následující.
- Identifikace a izolace požadovaného genu. (Amplifikace požadovaného genu pomocí PCR).
- Restrikční štěpení požadovaného genu (restrikční endonukleáza štěpí gen).
- Omezené trávení vektorové DNA. (Vektorová DNA je také štěpena pomocí stejné restrikční endonukleázy).
- Vložení genu do vektoru a tvorba rekombinantní molekuly.
- Transformace rekombinantního vektoru na hostitelskou bakterii.
- Izolace a identifikace transformovaných bakterií (plazmidový vektor by měl obsahovat selektovatelný gen, nejčastěji gen rezistence na antibiotika pro screening transformovaných bakterií).
- Rekombinantní genová exprese v hostiteli.
Obrázek_01: Postup klonování
Co je subklonování?
Subklonování je postup přesunu požadovaného genu z jednoho vektoru do jiného vektoru, aby se viděla exprese genu za účelem získání požadované funkce genu. V této metodě jsou zahrnuty dva vektory; jmenovitě rodičovský vektor a cílový vektor. Klonované vložky se v subklonování přesunou znovu do druhého vektoru. Cílem přenosu genu z prvního vektoru do druhého vektoru je získat něco, co by nebylo možné provést prvním vektorem, nebo znovu oddělit gen v již klonovaném fragmentu DNA a exprimovat to samostatně. V tomto postupu se na začátku používají restrikční enzymy.
Postup subklonování
Základní kroky subklonování jsou následující.
- Pomocí restrikčních endonukleáz separace požadované DNA v donorovém plazmidu (rodičovský vektor).
- Amplifikace požadované DNA pomocí PCR.
- Čištění produktu PCR (DNA zájmu) gelovou elektroforézou.
- Otevření recipientního plazmidu stejnými restrikčními endonukleázami použitými k oddělení požadované DNA v původním plazmidu.
- Ligací požadované DNA (genu) do recipientního plazmidu se vytvořil subklonovaný plazmid.
- Transformace subklonovaného vektoru na kompetentní hostitelskou bakterii.
- Screening transformovaných buněk.
- Čištění plazmidové DNA a použití pro sekvenování DNA nebo expresi genů k získání požadovaných produktů.
Subklonování se provádí při příležitostech izolace jednoho genu z klonované skupiny genů nebo když je požadovaný gen požadován k přenosu do užitečného plazmidu, aby byla vidět přesná funkce požadovaného genu.
Obrázek_02: Postup subklonování
Jaký je rozdíl mezi klonováním a subklonováním?
Rozdílný článek uprostřed před tabulkou
Klonování vs. subklonování |
|
| Klonování je postup, při kterém se produkují geneticky identické organismy nebo buňky. | Subklonování je postup přesunu požadovaného genu z jednoho vektoru do jiného vektoru, aby se viděla exprese genu za účelem získání požadované funkce genu. |
| Proces | |
| Oddělte požadovanou DNA od organismu a jednou ji vložte do vektoru a klonujte | Již klonovaná DNA je oddělena od prvního vektoru a vložena do druhého vektoru a klonována. |
| Vložte pohyb pomocí vektorů | |
| Nepřesune inzerty (DNA, která nás zajímá) z jednoho vektoru do jiného vektoru. | Přesuňte vložky z nadřazeného vektoru do cílového vektoru. |
Shrnutí - Klonování vs Subklonování
Klonování vytváří geneticky identické buňky nebo organismy s vloženým požadovaným genem nebo DNA. Probíhá separací a inzercí požadované DNA do vektoru a expresí v hostitelské bakterii. Subklonování sdílí podobné kroky s klonováním. Avšak v subklonování je již klonovaný fragment DNA (požadovaný gen) vložen do vektoru a transformován na hostitelskou bakterii. To je klíčový rozdíl mezi klonováním a subklonováním.
