Klíčovým rozdílem mezi helikázou a topoizomerázou je, že helikáza je enzym, který odděluje dva komplementární řetězce DNA rozbitím vodíkových vazeb mezi bázemi dvou řetězců, zatímco topoizomeráza je enzym, který odstraňuje pozitivní a negativní supercoily vznikající během procesu odvíjení DNA řezáním a opětovné uzavření jednoho nebo obou řetězců DNA duplexu.
DNA je dvojitá spirála. Existuje ve dvou komplementárních řetězcích spojených dohromady pomocí vodíkových vazeb. Replikace DNA, transkripce a oprava DNA vyžadují oddělení dvou řetězců od sebe, aby se vytvořily nové kopie, vytvořila mRNA a přidaly se k opravě nukleotidy. V tomto bodě vstupují do hry dva enzymy helikáza a topoizomeráza. Proto jsou při odvíjení DNA nezbytné jak helikáza, tak topoizomerázy. Helikáza odděluje dvouvláknovou DNA na jednořetězcová rozbitím vodíkových vazeb mezi páry nukleotidových bází ve dvouvláknové DNA. Naproti tomu topoizomeráza odkrývá zkroucení DNA a ulehčuje přirozenou supercoilovou DNA rozštěpením páteře fosfátové DNA buď v jednom nebo obou řetězcích.
