Klíčový rozdíl - SYBR Green vs Taqman
SYBR Green a Taqman jsou dvě metody používané k detekci nebo sledování procesu amplifikace PCR v reálném čase. SYBR Green je metoda založená na interkalaci barviva pro barvení nukleových kyselin, zatímco Taqman je metoda založená na hydrolýzní sondě. Obě technologie jsou navrženy tak, aby generovaly fluorescenci během PCR, což umožňuje přístroji v reálném čase sledovat reakci v „reálném čase“. Metoda SYBR Green se provádí za použití fluorescenčního barviva zvaného SYBR green a detekuje amplifikaci navázáním barviva na produkovanou dvouvláknovou DNA. Taqman se provádí pomocí dvojitě značených sond a detekuje amplifikaci degradací sondy Taq polymerázou a uvolněním fluoroforu. To je klíčový rozdíl mezi SYBR Green a Taqman.
OBSAH
1. Přehled a hlavní rozdíl
2. Co je SYBR Green
3. Co je Taqman
4. Porovnání vedle sebe - SYBR Green vs. Taqman
5. Shrnutí
Co je SYBR Green?
SYBR Green je fluorescenční barvivo používané k barvení nukleových kyselin, zejména dvouřetězcové DNA v molekulární biologii. Ke kvantifikaci produktů PCR během PCR v reálném čase se používá metoda SYBR Green. Jakmile se výsledný komplex DNA-barvivo váže na DNA, absorbuje modré světlo a vyzařuje intenzivní zelené světlo. Stává se to v důsledku strukturální změny, ke které dochází v molekule barviva po navázání na dvouvláknovou DNA. Když PCR vytváří více a více DNA, váže se více molekul barviva s DNA a vytváří více fluorescence. Proto se fluorescence zvyšuje s akumulací produktu PCR. Množství produktu PCR lze tedy kvantitativně měřit detekcí fluorescence SYBR Green.
SYBR zelené barvivo lze také použít pro značení DNA v cytometrii a fluorescenční mikroskopii. Ethidiumbromid byl úspěšně nahrazen SYBR Green, protože Ethidiumbromid je karcinogenní barvivo s problémy s likvidací během vizualizace DNA v gelové elektroforéze.
Existují výhody a nevýhody metody SYBR green. Tato metoda je velmi citlivá, levná a snadno použitelná. Avšak díky své schopnosti vázat se na jakoukoli dvouvláknovou DNA může nespecifická vazba vést k nadměrné kvantifikaci produktu PCR.
Obrázek 01: Zelená technika SYBR
Co je Taqman?
Taqman je alternativní metoda pro monitorování procesu PCR v reálném čase k SYBR Green. Tato metoda závisí na 5 '- 3' exonukleázové aktivitě enzymu Taq polymerázy k degradaci sond během prodloužení nového řetězce a uvolňování fluoroforu. V této metodě se používají dvojitě značené sondy, které jsou založeny na hydrolýze sond. Sondy jsou fluorescenčně značené DNA oligonukleotidy, které mají fluorescenční reportérovou molekulu (fluorofor) na 5 'konci a zhášecí molekulu na 3' konci. Jsou určeny k navázání na jednovláknovou šablonu na opačné straně žíhání primeru. Taq polymeráza přidává nukleotidy do primeru a prodlužuje nové vlákno směrem k dvojitě značeným sondám. Jakmile Taq polymeráza narazí na sondu, exonukleázový účinek Taq polymerázy aktivuje a degraduje sondu. Jakmile dokončí syntézu nového řetězce, je sonda podrobena úplné degradaci a uvolnění fluoroforu. Uvolňování fluoroforu generuje fluorescenci. Fluorescenční zhášecí molekula účinně uhasí emitované světlo a vytváří výstup pro kvantifikaci produktu PCR. Uvolňování fluoroforů a množství produktů PCR jsou úměrné. Kvantifikaci lze tedy snadno provést Taqmanovou metodou.kvantifikaci lze snadno provést Taqmanovou metodou.kvantifikaci lze snadno provést Taqmanovou metodou.
Obrázek 02: Taqmanova metoda
Metoda Taqman se používá v reálném čase PCR, kvantifikace genové exprese, detekce genetických polymorfismů, kvantifikace delecí chromozomální DNA, bakteriální identifikace, ověření microarray analýzy, genotypizace SNP atd.
Jaký je rozdíl mezi SYBR green a Taqman?
Rozdílný článek uprostřed před tabulkou
SYBR Green vs Taqman |
|
| SYBR Green je založen na barvivu vázajícím DNA. | Taqman závisí na hybridizačních sondách a 5 'až 3' exonukleázové aktivitě Taq polymerázy. |
| Fluorescenčně značené sondy | |
| Nejsou nutné žádné fluorescenčně značené sondy. | Jsou vyžadovány sondy se dvěma značkami. |
| Multiplexní genová analýza | |
| Nelze jej použít pro multiplexní genové cíle. | Může být použit pro multiplexní genové cíle. |
| Náklady | |
| To je levnější. | To je dražší. |
| Specifičnost | |
| To je méně specifické a váže se na jakoukoli dvouřetězcovou DNA | Jedná se o vysoce specifické, protože sondy detekují specifické produkty amplifikace. |
| Účinnost | |
| To je méně efektivní. | To je vysoce efektivní. |
| aplikace | |
| Používá se při PCR v reálném čase, vizualizaci na agarózovém gelu, značení DNA atd. | Používá se v reálném čase PCR, kvantifikace genové exprese, detekce genetických polymorfismů atd. |
Shrnutí - SYBR Green a Taqman
Taqman a SYBR green jsou dvě metody používané v real-time PCR (kvantitativní PCR). Obě metody umožňují efektivní kvantifikaci produktu PCR a spoléhají na emisi fluorescence. Metoda Taqman používá pro detekci nahromaděné DNA sondy se dvěma značkami, zatímco metoda SYBR Green používá fluorescenční barvivo. Obě tyto metody mají také různá použití v molekulární biologii.
