Klíčový rozdíl - Nick Translation vs Primer Extension
Nick nick a primer primer jsou dvě důležité techniky prováděné v molekulární biologii. Klíčovým rozdílem mezi translací nicku a prodloužením primeru je to, že proces translace nicku produkuje značené sondy pro jiné hybridizační techniky, zatímco metoda rozšíření primeru identifikuje specifickou sekvenci RNA ze směsi a odhaluje informace o expresi mRNA. Obě techniky mají velký význam a rutinně se provádějí v laboratořích molekulárního výzkumu.
OBSAH
1. Přehled a hlavní rozdíl
2. Co je Nick Translation
3. Co je Primer Extension
4. Porovnání vedle sebe - Nick Translation vs Primer Extension
5. Shrnutí
Co je Nick Translation?
Nickova translace je důležitá technika používaná k přípravě značených sond pro různé molekulárně biologické techniky, jako je blotování, in situ hybridizace, fluorescenční in situ hybridizace atd. Je to metoda značení DNA in vitro. DNA sondy se používají k identifikaci specifických sekvencí DNA nebo RNA. Pomocí značené sondy lze specifické fragmenty označit nebo vizualizovat ze složité směsi nukleové kyseliny. Značené sondy se proto připravují pomocí různých technik, které se používají pro různé techniky. Nick translation je jednou z takových metod, která produkuje značené sondy pomocí enzymů DNázy 1 a DNA polymerázy 1.
Proces překladu nicku začíná aktivitou enzymu DNázy 1. DNáza 1 zavádí zářezy do fosfátové kostry dvouvláknové DNA štěpením fosfodiesterových vazeb mezi nukleotidy. Jakmile je vytvořen nick, získá se volná 3 'OH skupina nukleotidu a bude na ni působit enzym DNA polymeráza 1. 5 'až 3' exonukleázová aktivita DNA polymerázy 1 odstraňuje nukleotidy z nicku ve směru 3 'směru řetězce DNA. Současně funguje polymerázová aktivita enzymu DNA polymerázy 1 a přidává nukleotidy, aby nahradily odstraněné nukleotidy. Pokud byly nukleotidy označeny, dojde k nahrazení značenými nukleotidy a označí DNA pro identifikaci. Tato nově syntetizovaná značená DNA může být použita jako sondy v různých hybridizačních reakcích v molekulární biologii.
Obrázek 01: Proces překladu přezdívek
Co je rozšíření primeru?
Prodloužení primeru je technika, která se používá k vyhledání specifické sekvence RNA ze směsi RNA a lokalizaci 5 'konce mRNA transkriptu. Používá se také ke studiu struktury RNA a exprese. Metoda extenze primeru se provádí se značenými primery nebo se značenými nukleotidy. Pokud se používají značené primery, vylučuje to potřebu značení nukleotidů, které se používají pro syntézu cDNA. V této technice existuje několik kroků. Začíná to extrakcí RNA ze vzorku. Poté se ke směsi přidá značený oligonukleotidový primer spolu s nezbytnými přísadami pro syntézu cDNA specifické sekvence RNA. Primer žíhá s komplementární sekvencí ze směsi. Použitím sekvence žíhané primerem jako šablony,enzym reverzní transkriptáza syntetizuje komplementární DNA (cDNA) sekvence RNA. K hybridizaci primeru a reverzní transkripci dochází pouze v případě, že je ve vzorku přítomna specifická sekvence RNA. Nakonec, když se provádí denaturační gelová elektroforéza, lze určit velikost sekvence RNA. Je také snadné najít +1 základnu sekvence mRNA (místo iniciace transkripce) metodou rozšíření primeru. Množství mRNA přítomné ve vzorku lze kvantifikovat touto metodou, pokud se použije nadbytek primeru. Je také snadné najít +1 základnu sekvence mRNA (místo iniciace transkripce) metodou extenze primeru. Množství mRNA přítomné ve vzorku lze kvantifikovat touto metodou, pokud se použije nadbytek primeru. Je také snadné najít +1 základnu sekvence mRNA (místo iniciace transkripce) metodou rozšíření primeru. Množství mRNA přítomné ve vzorku lze kvantifikovat touto metodou, pokud se použije nadbytek primeru.
Obrázek 02: Prodloužení primeru
Jaký je rozdíl mezi Nick Translation a Primer Extension?
Rozdílný článek uprostřed před tabulkou
Nick Translation vs Primer Extension |
|
| Nick translation je proces, který vytváří značené sondy DNA pro různé hybridizační reakce. | Prodloužení primeru je technika používaná k nalezení specifické RNA nebo ke studiu genové exprese. |
| Použité enzymy | |
| Používají se enzymy DNáza 1 a DNA polymeráza. | Používá se enzym reverzní transkriptázy. |
| Důležitost | |
| Nickový překlad usnadňuje značení specifické sekvence DNA. | Prodloužení primeru umožňuje detekci specifické velikosti sekvence mRNA a množství přítomného ve vzorku. |
Shrnutí - Nick Translation vs Primer Extension
Nick translation je metoda používaná k syntéze značených sond na základě aktivit DNA polymerázy 1 enzymů DNázy 1 a E coli. Jedná se o metodu in vitro používanou v laboratořích před různými hybridizačními technikami. Během translace nicku 5'-3 'exonukleázová aktivita DNA polymerázy 1 odstraňuje nukleotidy před nickem a polymerázová aktivita DNA polymerázy 1 nahrazuje odstraněné nukleotidy značenými nukleotidy za nickem. Prodloužení primeru je metoda, která se používá k detekci specifického transkriptu RNA ze směsi a kvantifikaci velikosti a množství požadované RNA. To je rozdíl mezi překladem nicku a prodloužením primeru.
