Rozdíl Mezi Northern Southern A Western Blot

2024 Autor: Mildred Bawerman | [email protected]. Naposledy změněno: 2023-12-16 08:37

Klíčový rozdíl - severní vs jižní vs západní blotování

Detekce specifických sekvencí DNA, RNA a proteinů je nezbytná pro různé typy studií v molekulární biologii. Gelová elektroforéza je technika, která odděluje DNA, RNA a proteiny podle jejich velikosti. Z gelových profilů jsou konkrétní sekvence DNA, sekvence RNA nebo protein detekovány speciálními technikami nazývanými blotování a hybridizace se značenými sondami. Existují tři různé typy blotovacích metod, jmenovitě jižní, severní a západní. Klíčový rozdíl mezi severním jižním a západním blotem spočívá v typu molekuly, kterou detekuje ze vzorku. Southern blot je metoda, která detekuje specifickou sekvenci DNA ze vzorku DNA. Northern blot je technika, která detekuje specifickou sekvenci RNA ze vzorku RNA. Western blot je metoda, která detekuje konkrétní protein ze vzorku proteinu.

OBSAH

1. Přehled a hlavní rozdíl

2. Co je Southern Blotting

3. Co je Northern Blotting

4. Co je Western Blot

5. Porovnání vedle sebe - Northern vs Southern vs Western Blot

6. Shrnutí

Co je Southern Blotting?

Technika Southern blotting byla vyvinuta společností EM Southern v roce 1975 pro identifikaci specifické sekvence DNA ze vzorku DNA. Toto je první blotovací technika zavedená v molekulární biologii. Umožnil detekci specifických genů z DNA, specifických fragmentů z DNA atd. V Southern blot technice je několik kroků. Jsou následující.

1. DNA je izolována ze vzorku a štěpena restrikčními endonukleázami.
2. Štěpený vzorek se oddělí elektroforézou na agarózovém gelu.
3. Fragmenty DNA v gelu jsou denaturovány na jednotlivé řetězce pomocí alkalického roztoku.
4. Jednovláknová DNA je přenesena na nitrocelulózovou filtrační membránu kapilárním přenosem.
5. Přenesená DNA je trvale fixována na membráně.
6. Fixovaná DNA na membráně je hybridizována se značenými sondami.
7. Nenavázaná DNA se promyje z membrány promytím.
8. Rentgenový film je vystaven membráně a je připraven autoradiograf.

Southern blot se používá pro různé aspekty molekulární biologie. Je užitečný při mapování RFLP, forenzních studiích, methylaci DNA v genové expresi, detekci mutovaných genů u genetických poruch, otisků prstů DNA atd.

Obrázek 01: Southern Blotting Technique

Co je Northern Blotting?

Northern blot je metoda určená k detekci specifické sekvence RNA nebo sekvence mRNA ze vzorku ke studiu genové exprese. Tato technika byla vyvinuta Alwinem, Kempem a Starkem v roce 1979. Liší se od postupů sourthern a western blot díky několika krokům. Tato technika se však také provádí gelovou elektroforézou, blotováním a hybridizací se specifickými značenými sondami a detekcí. Technika Northern blot se provádí následovně.

1. RNA je extrahována ze vzorku a oddělena gelovou elektroforézou.
2. RNA je přenesena z gelu na blotovací membránu a fixována.
3. Membrána je ošetřena značenou sondou připravenou z cDNA nebo RNA (sonda je komplementární se specifickou sekvencí ve vzorku).
4. Sonda se inkubuje s membránou, aby se navázala na specifickou sekvenci.
5. Nevázané sondy se odmyjí.
6. Hybridizované fragmenty jsou detekovány autoradiografem.

Northern blot je důležitým nástrojem při detekci a kvantifikaci hybridizované mRNA, studiu degradace RNA, hodnocení poločasu RNA, detekci sestřihu RNA, studiu genové exprese atd.

Obrázek 02: Northern blot

Co je Western Blotting?

Western blot je metoda detekce specifického proteinu ze směsi proteinů pomocí značené protilátky. Proto je western blot také známý jako imunoblot. Tuto techniku zavedli Towbin et al v roce 1979 a nyní se rutinně provádí v laboratořích pro analýzu proteinů. Kroky jsou následující.

1. Ze vzorku jsou extrahovány proteiny
2. Proteiny se dělí podle velikosti pomocí elektroforézy na polyakrylamidovém gelu
3. Oddělené molekuly jsou přeneseny na PVDF membránu nebo nitrocelulózovou membránu elektroporací
4. Membrána je blokována kvůli nespecifické vazbě s protilátkami
5. Přenesené proteiny se vážou na primární protilátku (protilátky značené enzymem).
6. Membrána se promyje, aby se odstranily nespecificky vázané primární protilátky
7. Navázané protilátky se detekují přidáním substrátu a detekcí vytvořené barevné sraženiny

Western blot je užitečný při detekci anti-HIV protilátek ve vzorku lidského séra. Western blot lze také použít jako potvrzující test na infekci hepatitidou B a definitivní test na nemoc šílených krav.

Obrázek 03: Western blot

Jaký je rozdíl mezi Northern Southern a Western Blotting?

Rozdílný článek uprostřed před tabulkou

Northern vs Southern vs Western Blotting
Zjištěný typ molekuly
Northern Blotting	Northern blot detekuje specifickou sekvenci RNA ze vzorku RNA.
Southern Blotting	Southern blot detekuje specifickou sekvenci DNA ze vzorku DNA.
Western blot	Western blot detekuje konkrétní protein ze vzorku proteinu.
Typ gelu
Northern Blotting	K tomu se používá gel z agarózy / formaldehydu.
Southern Blotting	K tomu se používá gel z agarózy.
Western blot	K tomu se používá polyakrylamidový gel.
Metoda blotování
Northern Blotting	Toto je kapilární přenos.
Southern Blotting	Toto je kapilární přenos.
Western blot	Toto je elektrický přenos.
Použité sondy
Northern Blotting	cDNA nebo RNA sondy značené radioaktivně nebo neradioaktivně.
Southern Blotting	DNA sondy jsou značeny radioaktivně nebo neradioaktivně.
Western blot	Jako sondy se používají primární protilátky.
Detekční systém
Northern Blotting	To se provádí pomocí autorádiografu nebo detekce změny světla nebo barvy.
Southern Blotting	To se provádí pomocí autorádiografu, detekce změny světla nebo barev.
Western blot	To se provádí pomocí detekce změny světla nebo barvy.

Shrnutí - Northern vs Southern vs Western Blotting

Blotování je speciální technika vyvinutá pro identifikaci specifické DNA, RNA nebo proteinu ze vzorků. K detekci konkrétního typu molekuly existují tři samostatné blotovací postupy, a to severní, jižní a západní. Technika Northern blot je navržena k detekci specifické sekvence RNA ze směsi RNA. Technika Southern blot umožňuje detekci specifické sekvence DNA ze vzorku DNA a technika Western blot je vyvinuta k identifikaci specifického proteinu ze směsi proteinů.